Takashi SAKATA R&D, Sysmex公司 4-4-4 Takatsukadai, Nishi-ku, Kobe 651-2271, Japan. 關鍵詞： 流式細胞儀 半導體激光 有核紅細胞 聚次甲基染料 介紹 有核紅細胞的測定除了能對地中海貧血等疾病的确診治療提供重要信息外，還能夠對慢性的骨髓組織增生性疾病，例如骨纖和慢性增生性白血病提供有用的信息。由于傳統方法(人工顯微鏡法)通常計數100個細胞所以在準确度和精密度存在問題。此外，典型慣用的血液分析儀不能完全區分有核紅細胞和白細胞，有核紅細胞影響了白細胞的計數。為了解決這些問題，運用不同的流式細胞儀技術改進了有核紅細胞的計數方法，但是幾乎沒有得到滿意的結果。 XE-2100使用了全新研發的有核紅細胞檢測試劑(STROMATOLYSER-NR) 和帶紅色半導體激光的流式細胞儀探頭得以精确地計數有核紅細胞。 本文闡述了有核紅細胞的檢測試劑(STROMATOLYSER- NR)和XE-2100有核紅細胞通道的檢測原理。此外，介紹了一種運用流式細胞儀的有核紅細胞計數的新的參考方法。 有核紅細胞檢測試劑(STROMATOLYSER-NR) 有核紅細胞檢測試劑(STROMATOLYSER-NR)包含了含聚次甲基的染料和含有表面活性劑的酸性低滲透稀釋液。下面介紹該試劑的成份和機制。 染液(聚次甲基染料) 對于細胞染色，不同的細胞使用不同的染料進行染色。總而言之，為使細胞染上顔色并能夠被流式細胞儀檢測到，這種染料必須具備下列特性: 1) 熒光性能：吸收光束的能力 （如：XE-2100 紅色半導體激光 波長 633nm） 2) 有細胞膜的滲透性，尤其是與所測細胞成分相關。 3) 隻有相關的靶細胞成份發出熒光。 4) 化學穩定性。 5) 低毒性 我們研發了滿足上述條件并在633nm半導體激光照射下發出熒光的聚次甲基染料。在現代工業中，聚次甲基染料作為一種常用的功能性染料，運用于近紅外吸收染料、激光染料、LB細胞膜和彩色膠片感光劑。在細胞儀領域，聚次甲基染料可被運用到細胞膜染色，但是它實際很少在血液學和病理學中用作染料。但是，它下述的特性使它非常适合用作細胞染色。 1) 聚次甲基染料的結構特點包含了一個環(含有氮、硫和氧的循環混合物)和一個甲基鍊(-CH2=)的捆綁結構，這種環已知是種螢光色基，許多染料都包含這種結構。（圖1） 圖1: 聚次甲基染料分子示意圖 理論上通過改變環的原子核的種類，捆綁的側鍊以及甲基鍊的長度可以設定聚次甲基染料的所吸收的波長。比如，捆綁結構中的甲基鍊上增加一個甲基，可以使聚次甲基染料所吸收的波長增加100nm. 這樣，聚次甲基染料具有優點就是通過改變染料分子結構相當容易地得到所希望吸收的波長。 2) 改變聚次甲基染料的分子結構不但可以容易地控制對細胞膜和細胞核膜的滲透性，還可以控制對細胞的親和力。通常，聚次甲基染料的分子結構上帶有陽離子，很容易與核酸、陰離子結合。它也可以和雙螺旋的DNA相結合。 在稀釋液的讨論中将描述細胞膜的滲透性。 3)聚次甲基染料的獨有特性是在水溶液中不能發出熒光，被吸收的光能通過分子内部的傳播運動轉化成熱能，一旦與細胞膜或核酸結合後，由于分子内部的傳播運動被阻礙，加大了聚次甲基染料光能的吸收和熒光強度。 4) 聚次甲基染料是一種化學性質不穩定的物質，它很容易被水、光和氧氣所分解。但是在STROMATOLYSER-NR中，運用乙烯乙二醇（非水的溶劑）作為儲存劑，聚次甲基染料變得相當穩定。另一方面，染料當作廢液排放到環境中會被分解，化學性質的不穩定反而變成優點。 5) 據報道聚次甲基染料是安全的，和典型的與核酸結合的熒光染料（乙基溴化物）相比具有很低的緻突變性。 據此，作為染料，聚次甲基染料具備了出色的性能。在XE-2100中，研發和使用最合适的聚次甲基染料不但可以用于有核紅細胞通道，還可以運用到4分類和網織紅細胞通道，多種的正常和異常細胞可以分類和計數。 稀釋液 （溶血素） 用全自動血液分析儀進行白細胞計數時，抗凝的外周血用适合的稀釋液稀釋。 下面講述稀釋液的一些作用。 1)全血的稀釋 如果全血沒有被稀釋就進行測量的話，對于血液分析儀來說，細胞的數量太多了以至于無法計數，因此樣本必須稀釋到一個合适的濃度使細胞可以一個個地通過測定儀。通常白細胞測定時，全血被稀釋10倍到100倍。 2) 紅細胞的溶解 在外周血中紅細胞的數量是白細胞的1000倍，這會幹擾有核紅細胞的計數。為了消除紅細胞的影響，紅細胞必須有選擇地溶解掉。 3) 細胞的處置 為了确切地染色和區分需要測量的細胞， 生理化學條件如pH值和離子濃度要依照所測量細胞調到最合适的值，在STROMATOLYSER-NR中用了酸性的低滲的溶液。 4) 染料滲透性的調整 聚次甲基染料具有相當好的細胞膜滲透性， 在STROMATOLYSER-NR中加入了一種染料滲透性促媒，能在短時間内完成染色(1/10秒内)。 稀釋液除了具備多種性能，比如溶解紅細胞、調整染色性能、增加染料滲透性以外，還要維持其他血細胞的形态。 本節詳細介紹紅細胞的溶解。 溶解紅細胞的四種基本方法： 1) 改變滲透壓 2) 在懸浮液中降低表面活性 3) 溶解細胞膜 4) 膜物質和其他物質之間強烈的生理化學的反應。(15) 已有多種溶解紅細胞的方法報道(16-21). 表1 溶血素 主要分類 優點 缺點 備注 低滲液 ? 對白細胞無損害 ? 能維持細胞的形态和特點 ? 通過液體的酸性pH值可以使紅細胞選擇性的溶解 ? 紅細胞被溶解，但是由于紅細胞的膜形成的碎片，所以不适合電阻抗的檢測方法。 ? 通常适用于光學方法。 陽離子激活劑 ? 非常快速的溶血反應 ? 相當少的紅細胞碎片 ? 細胞損害相當大，細胞的形态也可能改變。 ? 通常适用于電阻抗方法。 非離子表面活性劑 ? 非常快速的溶血反應 ? 紅細胞碎片徹底溶解 ? 細胞損害相當小。 ? 兩者都适合。 全自動血液分析儀用的溶血素分為三大類（表一），依據所測量的細胞選擇合适的溶血素。在STROMATOLYSER-NR稀釋液中紅細胞幾乎被全部溶解，酸性的低滲液含有陽離子表面激活劑使得有核紅細胞和白細胞的染色能力不同。 染色 大 強 小 弱 微小 尺寸 熒光 溶解 白細胞 有核紅細胞 紅細胞 圖2: 有核紅細胞通道測量原理 光栅 聚光鏡 二色鏡 聚光鏡 流式細胞 聚光鏡 光敏二極管 光電倍增器 633nm激 光二極管 濾光器 熒光管 （超過660nm的熒光） 圖3: 光學系統方框圖 有核紅細胞的測定原理 (圖2和 圖3) 将血液和有核紅細胞的測定試劑“STROMATOLYSER-NR”相混合，使紅細胞膜表面的脂質成份溶解，在細胞膜的表面形成孔道。紅細胞中的血紅蛋白滲出，隻剩下光學透明的細胞膜。有核紅細胞在相同的反應機制下，細胞表面形成孔道，在血紅蛋白滲出的同時，染液快速滲入。白細胞象有核紅細胞一樣在細胞表面形成孔道，染液快速滲入。白細胞的細胞器仍然存在細胞中，不溢出。在這種情況下，STROMATOLYSER-NR中的聚次甲基染料對核酸、細胞器、白細胞核進行染色。另一方面有核紅細胞的核很難和染料結合，因為它的核染色質發生固縮，不易着色。 着色後的細胞排成流式細胞，并被633nm的紅色激光束照射，測得細胞所産生的前向散射光強度和側熒光強度。二維散射圖的橫坐标表示側熒光強度、縱坐标表示前向散射光強度。 1) 由于紅細胞在稀釋液（溶血素）的作用下，隻剩下細胞膜（碎片），光散射很低，所以它的前向散射光強度很低。由于紅細胞的膜幾乎不能被染色，所以側熒光強度很低，它出現在原點附近的左下區域，這就是紅細胞碎片區。 2)白細胞在稀釋液的作用下，盡管在細胞膜的表面生成了孔道，但白細胞仍然保持了形狀，它的散射光很強；白細胞被聚次甲基染料強烈着色，它的側熒光強度很強，因而出現在散射圖的左上（或中間）的區域，就是白細胞區域。 3)有核紅細胞在稀釋液的作用下，核幾乎裸露，前向散射光強度較低，又因為細胞較難被聚次甲基染料着色，故而它出現在碎片區（低熒光強度）和白細胞區域之間，這是有核紅細胞區域。 圖4： 有核紅細胞散點圖 熒光強度 熒光強度 如上所述，由于有核紅細胞和白細胞兩者的前向散射光強度和側熒光強度不同，所以可以把兩者區分開來，有核紅細胞能被精确地計數和區分（圖４）。根據NCCLS H20- A22評估标準，用這種方法計數得到的有核紅細胞數大于20個／μL，可以用有核紅細胞的百分比(/100WBC) 和絕對值(/μL)表示。 有核紅細胞參考方法 一般地說，評價血液分析儀的白細胞分類能力，NCCLS H20-A的标準方法是使用顯微鏡鏡檢。人工的方法是一種極好的方法，它能夠對多種血液細胞進行評估，但是由于它計數的細胞數量少，所以它有衆所周知的統計學問題。雖然儀器進行細胞分類計數還是一個問題，人工方法不總是正确和客觀的方法。我公司設計了一種以流式細胞儀原理為基礎的參考方法，對血液分析儀的性能進行評估。最近我公司新設計了一種以流式細胞儀原理為基礎的有核紅細胞的參考方法，可對血液分析儀的有核紅細胞計數能力進行評估（圖5和6）。這種方法運用了單克隆抗體(标記CD45抗體的FITC)對每一種細胞都染色，能夠識别白細胞普通抗原、核酸染料（propidium iodide），特别能對有核紅細胞進行檢測和計數。所以，白細胞、有核紅細胞，紅細胞碎片能夠被清楚地區分開，有核紅細胞的百分比能被精确計數。這種方法測定了一萬個細胞（和人工方法計數100個白細胞相比較），它的精确性相當高。 下圖顯示了使用XE－2100和流式細胞儀測定有核紅細胞的評估結果，列舉了一個樣本的測定結果。 圖5：用流式細胞儀檢測有核紅細胞的例子 圖6：流式細胞儀與XE-2100檢測有核紅細胞的相關性 結論 多參數血液分析儀的技術能力被不斷地拓展。儀器現在測定和區分的細胞類型在以前被認為在“電子上”不能區分。在這份報告中，闡述了XE-2100計數有核紅細胞的原理，着重評估了STROMATOLYSER-NR試劑的性能。這些訊息将有助于确認XE－2100有核紅細胞計數的精确性和伴随的臨床應用。我們相信全自動血液分析儀在将來對于健康預防将不斷地給臨床帶來巨大的幫助，引進和解釋新的技術給你是我們永恒的任務。我們希望這将有助于你理解和樹立起信心，相信我們将來能計數那些目前還不能計數的細胞。 參考書目: 1 ) Schwartz FO, Stanbury F. : Significance of nucleated red blood cells in peripheral blood. 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